氧化葡萄糖酸杆菌胞内脱氢酶Gox0525的酶学性质研究

将氧化葡萄糖酸杆菌胞内脱氢酶推测基因Gox0525克隆至表达载体pET-28a(+)中,并在大肠杆菌中得到可溶性表达的蛋白,纯化后经HPLC以及SDS-PAGE检测,表明其活性形式为四聚体.重组蛋白Gox0525属于短链脱氢酶家族,选择该家族的催化底物谱测试,结果表明Gox0525具有还原二酮的能力,且专一性利用辅酶NADPH,在pH 9.0、30℃条件下活性较高,适合保存在pH 7.0、4℃条件下.酶反应的发生对金属离子无依赖性,添加Ca2+对酶活力有促进作用,而Fe3+有抑制作用.     

环己胺的微生物代谢及相关氧化酶的研究进展

环己胺氧化酶属于一种胺氧化酶,目前仅对动植物体内的胺氧化酶进行了系统研究,但对于不同微生物来源的环己胺氧化酶了解不够广泛。在微生物代谢途径中,参与上游代谢的基因具有丰富的多样性,而参与下游代谢途径的基因模块在不同的微生物中相对保守。因此,研究微生物代谢环己胺的关键是探讨催化环己胺生成环己酮的环己胺氧化酶的催化机制。该文综述了目前国内外微生物降解环己胺的研究进展,介绍了环己酮单加氧酶和环己胺氧化酶在有机胺的微生物代谢途径研究中的作用,并对其潜在应用前景进行了展望。     

用固定化氧化葡萄糖酸菌转化6-(N-羟乙基)胺基-6-脱氧-L-山梨呋喃糖

目的探索用固定化氧化葡萄糖酸菌转化6-(N-羟乙基)胺基-6-脱氧-L-山梨呋喃糖的最优条件。方法以海藻酸钠为载体把氧化葡萄糖酸菌固定化,考察固定化细胞在不同转化条件时对底物的转化率。结果通过条件优化,确定固定化细胞转化时间为24 h,底物质量浓度为10 g.L-1,采用的海藻酸钠质量浓度为40g.L-1,菌体包埋量为每g凝胶包埋3.1 g菌体,最适pH为7.0,最适温度为28℃,摇床转速要求高于100r.min-1;用60mmol.L-1的MnCl2替代原转化液中20mmol.L-1的MgSO4;固定化细胞与原游离细胞工艺相比,24h内底物转化率由原来的47%上升到93%,连续转化10次后,转化率仍为38%。结论用固定化氧化葡萄糖酸菌转化6-(N-羟乙基)胺基-6-脱氧-L-山梨呋喃糖,转化率提高46%并能连续转化约10次。     

米格列醇关键中间体6-(N-羟乙基)-6-脱氧-氨基山梨糖的生物合成工艺优化

目的:优化米格列醇关键中间体6-(N-羟乙基)-6-脱氧-氨基山梨糖的生物合成工艺。方法:以N-羟乙基葡糖胺作为原料,采用单因素试验方法优化工艺。分别考察了温度、转化时间、静息细胞浓度、底物浓度及起始pH对氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞生物催化合成6-脱氧-6-羟乙基氨基山梨糖的影响。结果:在静息细胞浓度10%、底物浓度15%、起始pH 7.0,1000 mL摇瓶装液150 mL,30℃,200 r.min-1条件下振荡转化10 h,底物转化率可达93%。结论:该生物转化工艺切实可行。     

氧化葡萄糖酸杆菌实时定量PCR检测方法的建立与应用

选取氧化葡萄糖酸杆菌16S rRNA作为看家基因,利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,以总基因组为模板,建立氧化葡萄糖酸杆菌实时定量PCR方法.选取山梨醇脱氢酶大亚基sldA和小亚基sldB为研究对象,以看家基因16S rRNA的表达作为内参,测得山梨醇脱氢酶大小亚基的转录水平一致,均为看家基因的68%.     

氧化葡萄糖杆菌ddsA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化异戊烯二磷酸与丙烯基二磷酸发生连续的综合反应生成聚十异戊烯焦磷酸，构成辅酶Q10的侧链。将氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的染色体DNA用EcoRI酶切，回收50kb左右的片段为模板，通过PCR扩增得到了聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因（ddsA）。测序分析表明该基因有一个951bp的开放型阅读框架，氨基酸序列与其他聚戊烯焦磷酸合成酶具有高度同源性（30％－50％）。将ddsA基因克隆到pUC19载体上得到pUC－GZH表达质粒，将其转入大肠杆菌JM83宿主，经IPTG诱导表达融合蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）的37ku处出现相应的条带。     

转化牛蒡子苷牛蒡内生菌的分离及L2菌株的鉴定

从牛蒡(Arctium lappa L.)的根、茎、叶、总苞、种子中分离纯化了57株内生菌。以牛蒡子粉为底物,采用高效液相色谱法定量测定转化培养液中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的含量,筛选得到6株转化牛蒡子苷的内生菌。其中L2的转化率最高,可达76.9%。利用LC-MS方法对其转化产物牛蒡子苷元进行了验证。L2经过形态观察、生理生化特征分析及16S rDNA序列分析,鉴定为氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)。本试验结果为探索牛蒡内生菌转化牛蒡子苷成主要药效成分牛蒡子苷元技术提供了科学依据。